Цифровая ПЦР в реальном времени – это усовершенствованная реал-тайм ПЦР технология, которая основана на разделении реакционной смеси по многочисленным ячейкам картриджа (более 20 000), каждая из которых является независимым реакционным пространством, в котором происходит амплификация целевого фрагмента НК. В результате значения флуоресценции, полученные от каждой ячейки, преобразовываются системой в двоичный код «1 и 0» в зависимости от того, произошла амплификация образца (флуоресценция обнаружена) или нет (отсутствие флуоресценции). Данный метод анализа обладает высокой чувствительностью и точностью и имеет предел обнаружения в 10 раз выше, чем у количественной ПЦР. Позволяет определить концентрацию целевого гена в исходном образце в числе копий данного гена на микролитр.
Системы цифровой ПЦР в реальном времени Optolane используют, встроенные в картриджи, сенсоры CMOS (комплементарный металл-оксид-полупроводник), которые включают в себя систему терморегулирования, необходимую для амплификации и репликации генов, а также детектор флуоресценции. Поскольку большинство ключевых функций анализаторов ПЦР интегрировано в полупроводниковый сенсор, приборы становятся более легкими и компактными.
Реакционная смесь, содержащая исследуемый образец, разделяется в картридже на множество отдельных реакционных пространств, (более 20000 ячеек), где происходят амплификация и флуоресцентное окрашивание. При этом распределение молекул ДНК по лункам картриджа происходит случайным образом, то есть отдельная ячейка может содержать или не содержать целевой ген. Детекция значений флуоресценции каждой ячейки позволяет отобразить результаты в виде двоичного кода «1 и 0» в зависимости от того, прошла реакция положительно (в ячейке присутствуют копии целевой НК) или отрицательно (в ячейке отсутствуют копии целевой НК). Оценка количества копий целевого гена в исследуемом образце проводится на основании распределения Пуассона.
1. ПЦР-микс с праймерами и зондами смешиваются с матрицей для проведения анализа.
2. Полученная реакционная смесь вводится в картридж с 20 000 ячеек, установленный на специальной рабочей станции для удобства работы. Затем крышки картриджа закрываются и убирается пленка на обратной стороне.
3. Картридж помещается в держатель Genotizer, а затем в On-Point анализатор.
4. Цифровая ПЦР в реальном времени производится в приборе On-Point, после чего результаты автоматически анализируются и сохраняются.
1. Количественная оценка онкологических биомаркеров. Для обнаружения биомаркеров, например, SNP, широко используют ПЦР в реальном времени или NGS секвенирование. Однако эти методы имеют существенное ограничение в обнаружении мутаций с низкой концентрацией, ввиду высокого фона генов дикого типа, ингибирующих амплификацию мишени. Благодаря высокой чувствительности, цифровая ПЦР система способна детектировать и количественно определять редко встречающиеся мутации.
2. Геномная изменчивость. Геномная изменчивость включает в себя вариации числа копий генов (CNV), вставки генов, а также транслокацию и инверсию. CNV является причиной множества заболеваний, поэтому данный показатель используется в качестве диагностического стандарта, который детектируется чаще всего методом гибридизации in situ (ISH). Однако данный метод требует значительного времени, чувствителен к условиям хранения образца, а также демонстрирует высокую вариабельность результатов в зависимости от места проведения анализа. Метод цифровой ПЦР в реальном времени позволяет провести точный и быстрый анализ, основанный на отношении амплифицированной последовательности к референсной.
3. Исследования экспрессии генов. Благодаря высокой чувствительности цифровой ПЦР в реальном времени возможно точно определить различие в уровнях экспрессии генов-мишеней. Исследования показали, что сравнение цПЦР в реальном времени и количественной ПЦР при анализе экспрессии генов в образцах с низким содержанием нуклеиновых кислот и/или переменным количеством химических или белковых загрязнителей, цПЦР дает более точные, воспроизводимые и статистически достоверные результаты.
4. Анализ метилирования. Нарушения метилирования НК приводят к различным патологиям, которые вызваны активацией или инактивацией различных генов. Благодаря высокому разрешению цифровой ПЦР в реальном времени возможно обнаружение метилирования отдельных молекул.
5. Жидкостная биопсия. Жидкостная биопсия относится к технологии диагностики онкологических заболеваний путем обнаружения следов фрагментов ДНК, образующихся при разрушении раковых клеток в периферической крови. Генетические мутации можно легко идентифицировать с помощью цифровой ПЦР в реальном времени с использованием нуклеиновых кислот, выделенных из крови. Данная технология позволяет диагностировать заболевание, определить курс лечения и следить за состоянием пациента после прекращения лечения.
6. SingleCell анализ. Ввиду высокой чувствительность метода цифровой ПЦР в реальном времени возможно производить анализ генетического материала отдельных клеток, так как для успешного проведения реакции достаточно следовых концентраций нуклеиновых кислот.