Глутатион (GSH) – трипептид аминокислот глутамина, цистеина и глицина. Синтезируясь в цитозоле, GSH распространяется в большинство органелл клетки, и, как мощный антиоксидант, участвует в органоспецифических реакциях, поддерживая гомеостаз. Под действием глутатионпероксидазы GSH восстанавливает H2O2 до Н2О. Как результат GSH переходит в окисленную форму GSSG с последующим восстановлением благодаря ферменту глутатион - редуктазы.
Флуоресцентный зонд FreSHtracer™, благодаря своим небольшим размерам молекулы, способен беспрепятственно проникать в живые клетки и ее компоненты связываясь с активной тиоловой(SH) группой глутатиона. В ходе реакции меняются оптические свойства зонда. Несвязанный FreSHtracer возбуждается источником света 520нм, испуская свет с максимум флуоресценции 580нм. При связывании с глутатионом эмиссия составляет 510нм.
Оценка уровня Глутатиона методом проточной цитометрии позволяет быстро с высокой точностью определить уровень интенсивности флуоресценции клеток, обработанных FreSHtracer™.
Пробоподготовку клеточной культуры проводят в 6-луночном планшете, инкубируя в растворе среды (DMSO) и FreSHtracer™ в течении 90 минут. После промывки и обработки трипсином, среду заменяют на буфер с FreSHtracer™ и анализируют на проточном цитометре, оснащенным фиолетовым лазером (405 нм)
В случае целевой сортировки клеток, в качестве критерия селекции могут быть выбраны параметры интенсивности флуоресценции. Отсортированные клетки с высоким уровнем глутатиона используют для дальнейших исследований, в том числе в разработках медицинского клеточного продукта, молекулярных исследованиях транскриптома.
Визуализация уровня глутатиона в живых клетках возможна с помощью конфокальных или широкопольных микроскопов с инкубационными камерами при наличии необходимых источников возбуждения и систем фильтров. Пробоподготовка включает в себя инкубацию клеточных культур с FreSHtraсer в 96 луночном планшете.
Имиджер Image ExFluorer оптимизированы для работы с реагентами FreSHtracer™ и включают готовые протоколы анализа изображений, в том числе определение изменения уровня глутатиона при обработке H2O2 в реальном времени
Способность к восстановлению глутатиона - возможность клетки преобразовывать окисленный GSSG (окислитель – диамид (DA)) обратно в восстановленную и активную форму GSH. Определяется с помощью N-этилмалеимида (NEM), который при связывании с глутатионом препятствует его превращению обратно в восстановленную форму глутатиона. Отслеживается с помощью реагентов FreSHtracer™.
Производителем также предлагаются решения для изучения количества Глутатиона в органеллах клетки:
MitoFreSHtracer™ – набор для определения глутатиона на внутренней мембране митохондрий живых клеток, в случае изменения проницаемости мембраны и потери потенциала.
ERFreSHtracer™ – набор для определения Глутатиона в эндоплазматическом ретикулуме.
GolgiFreSHtracer™ – набор для определения Глутатиона в комплексе Гольджи.
FreSHtracer-diAM™ – реагент повышенной чувствительности типа FreSHtracer, коньюгированный с ацетоксиметил сложным эфиром, который, попадая внутрь клетки, расщепляется, образуя два отрицательных заряда. Этот процесс препятствует обратному выходу реагента из клетки, что значительно уменьшает фоновый сигнал и увеличивает интенсивность свечения.
